La Cell Factory ‘Franco Calori’

Quando e perché?

La Cell Factory ‘Franco Calori’ della Fondazione Ospedale Maggiore Policlinico, Mangiagalli e Regina Elena di Milano è un laboratorio sterile in cui vengono coltivate cellule umane a scopo di trapianto. Intitolata al benefattore che, assieme alla Fondazione Il Sangue e alla Fondazione Cariplo ne ha generosamente finanziato la costruzione. La Cell Factory – ‘Fabbrica di Cellule’ –  opera con personale dedicato, specificamente formato secondo le norme di buona fabbricazione (Good Manufaturing Practices, GMP). Questa serie di norme molto stringenti e rigorose, utilizzate da molti anni dall’industria farmaceutica, devono oggi essere applicate anche alla produzione dei prodotti per terapia cellulare perché la direttiva europea 2004/23 ha equiparato i prodotti terapeutici contenenti cellule ai farmaci.

La Cell Factory ‘Franco Calori’ è tra le più recenti strutture realizzate nell’ambito del servizio trasfusionale del nostro Ospedale. Tale servizio, nato nel 1974 come ‘Centro Trasfusionale e di Immunologia dei Trapianti’, è divenuto, a partire dall’anno 2005, ‘Dipartimento di Medicina Rigenerativa’, e attualmente comprende tre Centri: (a) Trasfusionale e di Immunoematologia; (b) Immunologia dei Trapianti di Organi e Tessuti; e (c) Medicina Trasfusionale, Terapia Cellulare e Criobiologia. A quest’ultima unità operativa appartengono la Banca di Sangue Placentare di Milano – Milano Cord Blood Bank, la prima banca pubblica in Italia ad aver iniziato, nel 1993, la raccolta sistematica del sangue placentare a scopo di trapianto allogenico – e la Cell Factory ‘Franco Calori’.

Nella seconda parte degli anni Novanta, contemporaneamente alle prime importanti scoperte sulle potenzialità terapeutiche delle cellule staminali, risultò evidente che le semplici metodiche di frazionamento del sangue utilizzate nei centri trasfusionali e nelle banche del sangue placentare non erano idonee a garantire la sicurezza di manipolazioni complesse e prolungate di particolari stipiti cellulari, come le cellule staminali. Inoltre, in molti casi la lavorazione di queste cellule non può essere eseguita in sacche multiple di plastica a circuito chiuso, che garantiscono la sterilità e la stabilità del contenuto. La comunità scientifica internazionale identificò quindi la necessità di costruire ambienti tecnologicamente sofisticati e totalmente dedicati a questo tipo di lavorazione (1). In tempi più recenti, e indipendentemente dal grado di manipolazione, l’Europa ha posto sotto l’egida delle norme GMP anche i prodotti per terapia cellulare nei quali le cellule presentano un fenotipo modificato o svolgono una funzione ‘non omologa’, cioè esercitano un effetto terapeutico diverso dalla loro originale funzione fisiologica (ad esempio, una cellula staminale emopoietica trapiantata allo scopo di generare nuovi vasi sanguigni in un miocardio danneggiato da un infarto).

Come e chi?

Dopo aver inizialmente valutato l’ipotesi di un addestramento di tipo tradizionale, ci siamo resi conto che la formazione sul campo (il cosiddetto ‘training-on-the job’) costituiva la strategia più efficace per il raggiungimento dell’obiettivo che ci eravamo prefissati: quello cioè di sviluppare, all’interno del nostro Ospedale, una struttura certificata secondo le norme GMP. Va rilevato che nessun ospedale pubblico italiano possedeva allora una struttura GMP. Pertanto, all’inizio del programma un medico del Centro con una specializzazione in ematologia clinica e di laboratorio e con esperienza clinica nell’ambito del trapianto di cellule emopoietiche ha seguito un corso di formazione di tre mesi in una rinomata struttura GMP pubblica degli Stati Uniti. Accanto al significativo beneficio di natura professionale, la certificazione conseguita dal medico negli Stati Uniti è stata utile per l’acquisizione formale, in Italia, della qualifica di ‘Direttore Tecnico GMP’, preliminare indispensabile per la certificazione della Cell Factory. Tale certificazione viene rilasciata in Italia dal Ministero della Salute, con la collaborazione dell’Istituto Superiore di Sanità e dell’Agenzia Italiana del Farmaco (AIFA).

Parallelamente all’acquisizione delle necessarie professionalità, abbiamo avviato il progetto di costruzione della Cell Factory. L’unico spazio disponibile – purtroppo assai contenuto, ma di dimensioni appropriate in rapporto alle risorse economiche disponibili – comprendeva un’area di circa 80 m² situata all’ultimo piano del Padiglione Marangoni, un edificio la cui struttura iniziale risale al XVII secolo e nel quale sono presenti importanti vincoli architettonici. Il progetto iniziale consisteva nella realizzazione di due camere sterili. Nonostante lo svantaggio delle dimensioni assai contenute, l’ubicazione presentava il vantaggio di essere distante dalle zone di più intenso passaggio all’interno del nostro Dipartimento – al contrario del primo piano dove transitano quotidianamente più di 100 donatori di sangue – e di consentire l’aspirazione di grandi volumi di aria meno contaminata rispetto ai piani inferiori, necessari a garantire il ricambio dell’aria nelle camere sterili in conformità ai requisiti GMP.

La realizzazione della Cell Factory ha richiesto il superamento di alcune difficoltà di carattere tecnico, derivanti principalmente dallo spazio ristretto e dai vincoli architettonici. Nonostante tali difficoltà, era comunque necessario definire una corretta disposizione dei laboratori così da garantire che le cappe a flusso laminare in cui si manipolano le cellule (che presentano la più bassa classe di contaminazione – il livello A) fossero collocate in un ambiente in classe B circondato da un’area in classe C, a sua volta comunicante con una zona in classe D – secondo il concetto della classe di contaminazione progressiva. Era inoltre necessario riservare, in conformità alle norme GMP, uno spazio controllato adeguato per l’ingresso, la vestizione, il cambio degli abiti e l’uscita degli operatori e dedicare una parte dell’area alla quarantena e al controllo di qualità dei materiali.

Similmente all’esperienza di molti altri colleghi a livello internazionale, anche la nostra struttura, completata nel 2000, non ottenne subito la piena approvazione dell’ente di certificazione nella sua configurazione iniziale. Gli ispettori infatti richiesero alcune revisioni strutturali e operative, successivamente eseguite. Dopo aver completato tali revisioni e aver concluso un lungo processo di ri-validazione della struttura e delle procedure, la Cell Factory ‘Franco Calori’ ha ottenuto dall’AIFA la certificazione GMP il 5 luglio 2007, entrando così a far parte di un primo gruppo di tre officine farmaceutiche ospedaliere dedicate alla terapia cellulare, presenti presso strutture sanitarie pubbliche nazionali.

La rete ‘REPLACE’

Sulla scorta della positiva esperienza maturata dal Gruppo statunitense PACT  (Production Assistance for Cellular Therapy – www.pactgroup.org), nel 2007 le tre Cell Factory lombarde certificate  di Milano, Monza e Bergamo, e la Cell Factory della Fondazione ‘Istituto Neurologico Carlo Besta’ di Milano, hanno costituito la rete REPLACE (Rete Pubblica Lombarda per l’Avanzamento degli Studi GMP sulle Cellule Staminali). E’ questa la prima rete italiana, in ambito ospedaliero pubblico, di Cell Factory certificate dedicate alla terapia cellulare. Il primo obiettivo di REPLACE è promuovere la standardizzazione di alcune procedure basilari (raccolta, purificazione, coltura, caratterizzazione, criopreservazione, controllo di qualità, conservazione e trasporto), che svolgono un ruolo chiave nella manipolazione a scopo terapeutico di specifiche popolazioni di cellule staminali. Nell’ambito delle cellule staminali adulte, che rappresentano l’area di ricerca prevalente nelle Cell Factory che fanno parte di REPLACE, saranno principalmente studiate le cellule CD34+, CD133+, le Cellule Staminali Mesenchimali, le Cellule Staminali Neuronali, i Progenitori Vascolari e i Periciti. Un altro obiettivo del gruppo è definire un curriculum professionale per gli operatori delle Cell Factory conforme alle norme GMP.

 I costi

A fianco del significativo supporto dato dalle direzioni tecnica ed amministrativa del nostro ospedale, lo sviluppo della Cell Factory ‘Franco Calori’ (costruzione, revisione, validazione e monitoraggio degli impianti e acquisto delle attrezzature necessarie) ha richiesto il contributo di benefattori, di fondazioni private, come la Fondazione Il Sangue e la Fondazione Cariplo, e un finanziamento da parte del Ministero della Salute (progetto Stem Bank 2003). L’intero progetto, dal suo esordio all’acquisizione della certificazione GMP, ha avuto una durata di 10 anni e ha comportato una spesa di circa un milione di euro, escludendo i costi del tempo dedicato dallo staff alla progettazione in collaborazione con la società che ha realizzato gli impianti e allo sviluppo del sistema qualità. E’ verosimile che, sulla base delle esperienze acquisite presso le tre Cell Factory già certificate a livello nazionale, un percorso di costruzione, validazione e certificazione di una Cell Factory GMP presso un ospedale pubblico possa ora essere completato entro 2-3 anni dall’acquisizione delle necessarie risorse economiche.

L’organizzazione attuale e le prospettive future

L’organizzazione del lavoro presso una Cell Factory e l’operatività giornaliera del suo staff (nel nostro caso 2 medici, 5 biologi, 1 bio-tecnologo, 1 tecnico di laboratorio) presentano due elementi in apparente contraddizione. Il primo si riferisce alla necessità di seguire rigorosamente le norme GMP durante la preparazione dei prodotti cellulari a scopo terapeutico, secondo procedure validate con criteri specifici per la vestizione degli operatori, per la centrifugazione dei prodotti, per il controllo di qualità dei materiali, per la pipettatura dei reagenti, lo smaltimento dei rifiuti, la registrazione dei dati, il rilascio dei prodotti, ecc. Il secondo è rappresentato dalla necessità di non perdere la creatività del ricercatore, spesso disordinata e casuale, ma proprio per questo capace di esprimere grandi idee innovative. Ciò richiede una leadership co-gestita da parte del medico che ha la formale responsabilità della preparazione dei prodotti terapeutici e del biologo responsabile della ricerca e dello sviluppo pre-clinico in laboratorio. Entrambi possiedono nella nostra Cell Factory la qualifica di Direttore Tecnico GMP, una qualificazione importante per comprendere appieno tutti gli elementi del processo che iniziano con il concepimento di un’idea di ricerca e si concludono con la preparazione del prodotto clinico finito e con la sua somministrazione.

Attualmente, la Cell Factory ‘Franco Calori’ è impegnata nello studio e nella preparazione di prodotti cellulari in ematologia, neurologia, cardiologia, otorinolaringoiatria, prevalentemente nell’ambito di studi clinici di fase  I-II (3-5).

Stiamo inoltre mettendo a punto il progetto esecutivo per la definitiva ubicazione della Cell Factory ‘Franco Calori’ e di una biobanca ad essa associata, con un capacità di 5 milioni di campioni di materiali biologici, grazie ad una generosa donazione fatta alla Fondazione. La nuova Cell Factory comprenderà 4 camere sterili in pressione positiva e 1 in pressione negativa, con un’estensione complessiva di circa 400 m². La biobanca ad essa associata, presso la quale saranno conservate anche tutte le donazioni di sangue placentare della Milano Cord Blood Bank, coprirà un’area di 900 m².

Sulla base dell’esperienza sin qui maturata, crediamo che l’azione più significativa da intraprendere perché la terapia cellulare progredisca anche nel nostro Paese sia la promozione della collaborazione fra le Cell Factory certificate GMP a livello nazionale e i clinici interessati a sperimentare le proprietà terapeutiche delle cellule staminali e di popolazioni selezionate di cellule più mature, ingegnerizzate per interferire con il sistema immunitario, combattere le patologie neoplastiche e trattare infezioni resistenti ai protocolli terapeutici attualmente disponibili.

Ringraziamenti. Questo lavoro è stato reso possibile grazie al contributo del Ministero della Salute (Progetto StemBank 2003; ricerca Finalizzata 2005; Progetto a concorso e 2007, Ex Art. 56), dell’Istituto Superiore di Sanità (Malattie Neurodegenerative), del VI Programma Quadro dell’Unione Europea – THERCORD, della Fondazione Il Sangue (2003-2007); ADISCO Sezione Regionale Lombardia (2003-2007).

Bibliografia

1. Giordano R, Lazzari L, Rebulla P. Clinical grade cell manipulation. Vox Sang 2004;87:65-72.
2. Directive 2004/23/EC of the European Parliament and of the Council of 31 March 2004 on setting standards of quality and safety for the donation, procurement, testing, processing, preservation, storage and distribution of human tissues and cells. Official Journal of the European Union, 7 April 2004.
3. Gammaitoni L, Lucchi S, Bruno S, Tesio M, Gunetti M, Pignochino Y, Migliardi G, Lazzari L, Aglietta M, Rebulla P, Piacibello W. Serial transplantations in nonobese diabetic/severe combined immunodeficiency mice of transduced human CD34+ cord blood cells: efficient oncoretroviral gene transfer and ex vivo expansion under serum-free conditions. Stem Cells. 2006;24:1201-12.
4. Zangrossi S, Marabese M, Broggini M, Giordano R, D’Erasmo M, Montelatici E, Intini D, Neri A, Pesce M, Rebulla P, Lazzari L.  Oct-4 expression in adult human differentiated cells challenges its role as a pure stem cell marker. Stem Cells. 2007;25:1675-80.
5. Ciulla MM, Ferrero S, Montelatici E, Gianelli U, Braidotti P, Calderoni S, Paliotti R, Annoni G, De Camilli E, Busca G, Magrini F, Bosari S, Lazzari L, Rebulla P. Assessment of selective homing and contribution to vessel formation of cryopreserved peripherally injected bone marrow mononuclear cells following experimental myocardial damage. Cardiovasc Hematol Disord Drug Targets. 2006;6:141-9.